Cos’è la Fibrosi Cistica?
La fibrosi cistica (FC) è una grave malattia ereditaria, cronica, evolutiva; un bambino ogni 2700 nasce con questa malattia. Nei pazienti affetti da FC le secrezioni delle ghiandole esocrine, (cioè i liquidi biologici come il muco, il sudore, la saliva lo sperma, i succhi gastrici) sono molto più dense e viscose del normale. I problemi più gravi sono a carico dei polmoni, dove il muco estremamente denso può causare problemi respiratori e infezioni. Anche i succhi pancreatici sono più densi del normale, causando problemi digestivi.
Infine, i pazienti affetti da FC sono scarsamente fertili, a causa dell’eccessiva densità del loro liquido spermatico e delle secrezioni vaginali. La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, e può esprimersi con maggiore o minore gravità in individui diversi. Pertanto viene trattata con terapie che variano da soggetto a soggetto, costituite per lo più da fisioterapia, antibiotici, aerosol-terapia, estratti pancreatici e vitamine. Il decorso e la prognosi della fibrosi cistica sono notevolmente migliorati negli ultimi decenni, soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente. Nonostante ciò, allo stato attuale la guarigione non è possibile e la durata media della vita è comunque ancora ridotta rispetto a quella della popolazione generale.
Come si trasmette la Fibrosi Cistica?
La FC è una malattia che si trasmette con modalità autosomica recessiva, determinata da alterazioni del DNA, chiamate “mutazioni” che insorgono in entrambe le copie del gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). I geni vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. Negli individui malati entrambe le copie del gene per la FC sono alterate. Gli individui che possiedono una sola copia del gene alterato e una normale sono invece privi di ogni sintomo, ma sono portatori sani. I bambini malati di FC potranno nascere solo se entrambi i genitori sono almeno portatori sani. Due genitori portatori sani avranno una probabilità del 25 % di avere figli affetti da FC. Dalla stessa unione i figli avranno una probabilità su due (50%) di nascere portatori sani, come i genitori.
Come si esegue l’analisi genetica per la Fibrosi Cistica? L’unico modo per identificare i portatori sani è quello di effettuare un test sul DNA alla ricerca di mutazioni nel gene della FC. L’analisi però è complicata dal fatto che esistono numerosissime mutazioni (ad oggi oltre 900) che causano la FC; molte di esse sono rare, molte altre ancora sconosciute. Generalmente, il test genetico viene eseguito tenendo conto di 31-200 mutazioni (a seconda del tipo di analisi effettuata), scelte fra le più frequenti nell’area geografica in questione e che nel complesso permette di identificare circa 90 per cento dei portatori. Il test genetico non è in grado di identificarle tutte. In casi particolari, adeguatamente valutati dal genetista, può essere eseguito anche un test genetico che prevede l’analisi di mutazione dell’intero gene, con conseguente ricerca di tutte le mutazioni sinora scoperte. Il gene responsabile della malattia è stato identificato e localizzato sul cromosoma 7. Il gene codifica per una proteina chiamata CFTR (Cystic fibrosis transmembrane regulator). La proteina CFTR ha un ruolo importante nel regolare la quantità di cloro che viene secreto insieme ai liquidi biologici. Nei pazienti affetti da FC il gene della CFTR è alterato, in genere a causa di mutazioni puntiformi. Queste alterazioni fanno sì che la proteina non venga più prodotta, o che venga prodotta ma in una forma non funzionale. A causa del deficit della proteina, le secrezioni contengono una scarsa quantità di acqua di sali, che ne modifica drasticamente le proprietà.
Che risultati può dare l’analisi genetica per la Fibrosi Cistica?
A seguito dell’analisi genetica per Fibrosi Cistica si possono ottenere due tipi di risultati:
- L’analisi può individuare nel DNA del paziente la presenza di una mutazione a livello di una copia del gene CFTR, mentre l’altra copia è normale. Si dice che il soggetto risulta portatore in eterozigosi di quella mutazione, e questo risultato significa che il paziente è un PORTATORE SANO.
- L’analisi può individuare nel DNA del paziente la presenza di mutazioni in entrambe le copie del gene CFTR. Si dice che il soggetto risulta eterozigote composto (due mutazioni diverse) o omozigote (due mutazioni uguali) di quella/e mutazione/i; questo risultato significa che il paziente è un AFFETTO da Fibrosi Cistica.
- L’analisi genetica non individua nel DNA del paziente la presenza di mutazioni del gene CFTR. Si dice che il soggetto risulta “NEGATIVO”. Questo risultato significa che il soggetto ha una probabilità diminuita, rispetto a prima dell’analisi, di essere un portatore.
Non è possibile che l’analisi escluda in assoluto la probabilità di essere un portatore, perché non è possibile escludere la presenza di tutte le numerosissime mutazioni del gene della fibrosi cistica. È importante ricordare che:
la probabilità di essere un portatore di fibrosi cistica è maggiore per un soggetto che sia parente di un malato o di un portatore. In questo caso è necessario prima identificare la mutazione del malato o del portatore presente in famiglia (mutazione “familiare”) e poi ricercarla nel parente. Se il parente risulta non avere nel suo DNA la mutazione familiare, la sua probabilità di essere portatore diventa estremamente bassa.
La probabilità di essere portatore di fibrosi cistica è minore ma comunque presente anche nel soggetto che non è parente di un malato o di un portatore. In questo caso, per chi si sottopone alla ricerca delle più frequenti mutazioni del gene della fibrosi cistica e non risulta avere nel suo DNA nessuna di queste, la probabilità di essere portatore diventa bassa (anche se non zero) (Tabella 1).
Fibrosi Cistica ed infertilità
Una caratteristica ricorrente tra i maschi con Fibrosi Cistica è l’infertilità, che si associa alla patologia ostruttiva e spesso all’agenesia bilaterale congenita dei vasi deferenti (CBAVD). Questo difetto costituisce circa il 15% delle cause di sterilità maschile che nel 80% dei casi è riconducibile a mutazioni di del gene CFTR. Alcune di queste mutazioni come R117H, N1303K e G551D sono molto comuni nei pazienti con CBAVD, in associazione alla Delta F508, che è presente in eterozigoti nel 57% di pazienti maschi. E’ stata anche dimostrata una correlazione tra questa malformazione e una variante allelica polimorfa del gene CFTR, conosciuta come polimorfismo 5T, che mostra una frequenza nei CBAVD circa 4- 6 volte superiore rispetto alla popolazione generale. Il polimorfismo consiste in una regione di polipirimidine (polyT) di lunghezza variabile all’interno dell’introne 8 del gene CFTR. La variabilità si manifesta sotto forma di tre alleli, chiamati 5T, 7T, 9T, a seconda del numero di timine presenti. In particolare, l’allele 5T è associato ai cromosomi mutati dei maschi con CBAVD. Questo polimorfismo intronico regola il meccanismo molecolare del processo di maturazione dell’RNA messaggero (mRNA) e quindi la quantità di trascritto CFTR all’interno della cellula. La presenza di un allele 5T si accompagna ad una sintesi di mRNA che manca dell’esone 9 (ex9-) per il 90%, l’assetto 7T presenta il 25% di mRNA ex9- mentre in quello 9T il 90% dell’mRNA è normale. Si ipotizza che una quantità ridotta di mRNA provochi questa forma incompleta o variante di FC, che viene trasmessa da genitori eterozigoti.
Varianti del gene CFTR e incidenza
Il gene regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) identificato nel 1989 si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e contiene 27 esoni codificanti distribuiti su oltre 230 kb4. Un mRNA di 6,5 kb prodotto dall’allele normale codifica il gene CFTR, una proteina integrale di 1490 aminoacidi situata sulla membrana che funziona come canale di cloro regolato nelle cellule epiteliali di più organi4,5. Attualmente sono state descritte oltre 1900 varianti del gene CFTR. Per la maggior parte si tratta di mutazioni puntiformi9. La variante del gene CFTR più comune è l’allele F508del5, che rappresenta quasi il 70% di tutte le varianti del gene CFTR3. Tuttavia altre varianti comuni del gene CFTR spesso determinano un fenotipo CF e altre patologie correlate a CFTR3-5.
Panoramica del progetto CFTR2
Il progetto CFTR2 è un’iniziativa internazionale guidata da un team di ricercatori e medici e supportata dal National Institute of Health e dalla fondazione statunitense Cystic Fibrosis Foundation.11,12 CFTR2 mira a fornire informazioni complete e riviste da esperti sulle varianti funzionali e cliniche del gene CFTR. In uno sforzo per convalidare clinicamente tutte le varianti CF con frequenze alleliche di 0,01% e di percentuali superiori, 25 archivi e cliniche CF d a tutto il mondo13 hanno unito le proprie risorse con lo scopo di confrontare le informazioni cliniche di più di 39.00 0 pazienti affetti da fibrosi cistica con circa 1.900 varianti del gene CF che sono stati registrati negli anni nel databa se CFTR1 dell’ospedale Hospital for Sick Children di Toronto.11,13 Le caratteristiche cliniche, come concentrazione di cloro nel sudore (% FEV1 prevista) e stato del pancreas sono stati analizzati assieme alle informazioni del genotipo CFTR. L’approccio sistematico di analisi simultanea di queste varianti da una prospettiva clinica, funzionale e genetica ha prodotto 134 varianti univoche causanti la fibrosi cistica a 129 posizioni genomiche univoche (poiché per cinque posizioni, due cambiamenti del nucleotide appaiono sulla stessa posizione) attualmente contenute nel database CFTR2 (ad agosto 2013). L’uso di un pannello comprendente tutte queste varianti si prevede che equivalga al 95,4% degli alleli (detection rate) che causano la fibrosi cistica e, mediante il rilevamento di entrambi gli alleli, aumenta a circa il 91% l’identificazione di coppie a rischio rispetto al 72% usando il pannello di 23 varianti raccomandato dalL’ACMG (American College of Medical Genetics). Mutazioni e varianti del gene CFTR investigate Le varianti del gene CFTR investigate sono state specificatamente scelte perché rappresentano il gruppo completo di varianti convalidate clinicamente classificate come causanti la fibrosi cistica nel database CFTR2 presso la Johns Hopkins University, un prodotto dell’iniziativa di CFTR2 (Clinical and Functional Translation of CFTR). Le varianti includono quelle raccomandate nel 2004 dall'American College of Medical Genetics (ACMG)1 e nel 2011 dall’American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG)2. Il saggio testa: 134 varianti che causano la fibrosi cistica; una variante del pannello raccomandata dall’ACMG (R 117H, classificata come mutazione di varie conseguenze cliniche, MVCC, da CFTR2); una variante modificante riportata condizionatamente (PolyT); e tre varianti benigne riportate condizionatamente (I506V, I507V, F508C)14; per un totale di 139 varianti riportate. Le 134 varianti che causano la fibrosi cistica corrispondono a 129 varianti che causano la fibrosi cistica contenute nel database CFTR2. Il database CFTR2 include cinque varianti che causano la fibrosi cistica per le quali lo stesso cambiamento nel livello della proteina può verificarsi da due cambiamenti distinti del nucleotide [ad es., S466X(C>A) e S466X(C>G)]. Queste cinque varianti sono elencate in base al codone di aminoacido nel database CFTR2 (ad es., S466X) mentre il saggio riporta ciascuna singola variante [ad es., S466X(C>A) e S466X(C>G)]. L’elenco delle 139 mutazioni e varianti sono fornite nella Tabella 2.
Tabella 2: Riepilogo delle 139 mutazioni e varianti investigate [Elencate in base alle coordinate genomiche; Grassetto=ACMG-23; In rosso sono indicate le mutazioni Italiane]
*Classificato nel database CFTR212 come una variante che causa la fibrosi cistica, mentre Sosnay13 classifica la variante come indeterminata. La classificazione in base al database è più attuale e riflette l’analisi funzionale completa, che non era disponibile al tempo della pubblicazione di Sosnay.
Accuratezza del test
L’accuratezza del test è stata stimata valutando 500 campioni che rappresentano una vasta gamma di varianti del gene CFTR da quattro fonti separate. La fonte principale dei dati di accuratezza è stato uno studio di accuratezza clinica condotto usando un pannello di 366 campioni. La maggior parte (n = 355) dei campioni consisteva di campioni clinici di gDNA archiviati, anonimizzati e isolati da sangue umano, i restanti 11 campioni sono stati ottenuti da campioni di linee cellulari disponibili in commercio. I dati di questo studio sono stati integrati con i dati di accuratezza ottenuti da 68 campioni di linee cellulari nello studio di riproducibilità, 14 campioni clinici ottenuti dallo studio di valutazione analitica del metodo di estrazione e 52 campioni di plasmidi sintetici. I plasmidi sintetici sono stati progettati per includere il contesto genomico di varianti rare e contenuti ovunque da una a nove varianti entro lo stesso costrutto. Sono stati linearizzati, diluiti a numero di co pie equivalenti di DNA genomico e miscelati con campioni di DNA genomico umano di genotipo wild type a numero di copie equivalenti per imitare un campione eterozigote. I risultati di genotipizzazione per 137 siti di SNV/piccoli Indel, inclusa la regione PolyT, sono stati confrontati con l’analisi bidirezionale delle sequenze di Sanger. Sono stati usati due saggi convalidati basati sulla PCR come metodo di riferimento per due ampie delezioni nel pannello. Ciascun saggio di duplex PCR ha utilizzato due gruppi di primer per discriminare tra genotipi wild type, eterozigote e omozigote. Uno dei gruppi di primer è stato progettato per affiancare i punti di rottura delle delezioni, mentre l’altro gruppo ha amplificato una regione interna alla delezione. I due prodotti sono stati rilevati mediante separazione in base alla dimensione su un gel di agarosio. I saggi PCR sono stati convalidati usando un pannello di 28 campioni in tutto (22 campioni per ciascuna delezione) che consiste di campioni di DNA genomico di linee cellulari e derivati dal sangue e plasmidi sintetici, che hanno incluso i genotipi WT, HET e HOM per ciascuna ampia delezione. È stato confermato che i saggi PCR presentano una specificità e una riproducibilità del 100% per tutti i campioni testati, mediante la valutazione dei prodotti della PCR su un gel di agarosio. L’accuratezza dei saggi PCR è stata confermata usando il sequenziamento Sanger ed è stata del 100% per tutti i campioni. L’accuratezza è stata determinata per ogni genotipo attraverso tre misurazioni statistiche. La concordanza positiva è stata calcolata per ciascun genotipo di variante dividendo il numero di campioni con identificazioni di varianti concordanti per il numero totale di campioni con detta variante come identificata dai metodi di riferimento. La concordanza negativa è stata calcolata su tutte le posizioni wild type (WT) dividendo il numero di posizioni WT concordanti per il numero di posizioni WT come definiti dai metodi di riferimento. La concordanza complessiva (OA) è stata calco lata su tutte le posizioni riportate dividendo il numero di posizioni di WT e delle varianti concordanti per il numero di posizioni riportate come determinate dai metodi di riferimento. Il test presenta una concordanza positiva (PA) a livello di genotipo del 100%. La concordanza negativa (NA) per tutte le posizioni WT era > 99,99% e la concordanza complessiva (OA) per tutte le posizioni riportate era > 99,99%. Tutti i risultati del test sono basati su test iniziali.
Limiti della procedura
- Per uso diagnostico in vitro. I risultati ottenuti dovrebbero essere usati e interpretati nel contesto di una valutazio e clinica completa.
- Il test è progettato per identificare uno specifico sottogruppo di varianti note nel gene CFTR, ma non include tutte le varianti identificate nel gene CFTR. Quindi, se una variante non viene identificata non garantisce che altre vari anti del gene CFTR non siano presenti nei campioni analizzati.
- La frequenza delle varianti identificate mediante questo test varia fra le diverse popolazioni. Come per qualsiasi test basato su ibridazione, i polimorfismi o le varianti latenti nelle regioni che legano gli oligonucleotidi possono incidere sugli alleli sondati e, di conseguenza, sulle identificazioni effettuate.
- Il saggio non può determinare se l’orientamento della variante PolyT si trova in cis/trans sulla variante R117H. Per i pazienti con una variante R117H, dovrebbero essere eseguiti ulteriori test per determinare se una variante PolyT, che può incidere sul fenotipo clinico [ad. es., 5T], è in orientamento cis/trans sulla variante R117H.
- PolyT sono regioni omopolimeriche note per essere difficili da interpretare con saggi basati sulle sequenze dovuti a scivolamento della polimerasi.
Descrizione tecnica dell’analisi
Il test, eseguito utilizzando il kit CE-IVD MiSeqDx Cystic Fibrosis 139-Variant Illumina, comporta due procedure principali. La prima consiste nel preparare i campioni per il sequenziamento, un’operazione detta preparazione della libreria. La preparazione della libreria consiste di quattro fasi principali: ibridazione, estensione-ligazione, amplificazione mediante PCR e normalizzazione della libreria. La seconda procedura consiste nel sequenziare il campione preparato mediante la chimica SBS (sequenziamento mediante sintesi) su MiSeqDx. Sequenziamento La chimica SBS utilizza un metodo che fa uso di terminatori reversibili per rilevare le singole basi nucleotidiche ma n mano che vengono incorporate in filamenti di DNA crescenti. Durante ciascun ciclo di sequenziamento, alla catena dell’acido nucleico viene aggiunto un solo deossinucleotide trifosfato (dNTP) marcato in fluorescenza. Il nucleotide marcato funge da terminatore per la polimerizzazione, così dopo ogni incorporazione di dNTP, il colorante fluorescente viene sottoposto a imaging al fine di identificare la base e quindi sottoposto a scissione enzimatica per consentire l’incorporazione del nucleotide successivo. Poiché tutti e quattro i dNTP legati al terminatore reversibile (A, G, T, C) sono presenti come molecole singole e separate, la competizione naturale riduce al minimo le distorsioni dovute all’incorporazione. Le identificazioni delle basi vengono effettuate direttamente dalle misurazioni dell’intensità del segnale durante ogni ciclo di sequenziamento. Il risultato finale è un sequenziamento base per base.
Analisi dei dati
MiSeq Reporter elabora le identificazioni delle basi generate durante l’analisi primaria e produce informazioni su ciascun campione in base alle informazioni specificate nel foglio campioni, questa elaborazione si chiama analisi secondaria. L’analisi secondaria include de-multiplex, generazione di file FASTQ, allineamento, identificazione delle varianti e generazioni di file VCF che contengono le informazioni relative alle varianti del gene CFTR individuate in posizioni specifiche in un genoma di riferimento. Demultiplex: il de-multiplex costituisce la prima fase dell’analisi se nel foglio campioni sono elencati più campioni e la corsa presenta letture indici. Il demultiplex separa i dati da un pool di campioni in base agli indici sequenza univoci che sono stati aggiunti durante la fase di amplificazione mediante PCR. Generazione di file FASTQ: dopo il de-multiplex, MiSeq Reporter genera file intermedi in formato FASTQ, un formato di testo utilizzato per rappresentare le sequenze. I file FASTQ contengono le letture di ciascun campione e i punteggi qualitativi, con l’esclusione delle letture dei cluster che non hanno attraversato il filtro. Allineamento: mediante l’allineamento è possibile confrontare le sequenze rispetto a un riferimento al fine di identificare una relazione fra le sequenze e assegnare un punteggio in base a regioni di similarità. Le letture allineate sono scritte nei file in formato BAM. MiSeq Reporter utilizza un algoritmo di Smith-Waterman con matrice a banda che esegue allineamenti locali di sequenze per determinare il grado di similarità fra due sequenze. Identificazioni delle varianti: durante questa fase vengono registrate le varianti di singolo nucleotide (SNV), le inserzioni e delezioni (Indel) e altre varianti strutturali in un file di testo standardizzato chiamato MiSeqDxCF139 Variant Assay.txt.. Livello Diagnostico: II^ livello Screening 139 Mutazioni Detection Rate: 95.4%
Referto ottenuto in collaborazione con:
Eurofins Genoma Group
Sede Legale, Laboratori e Studi Medici – Roma
Via di Castel Giubileo, 11 – 00138 Roma (RM)
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Fax +39 06 64.49.20.25
